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        ELISA實驗結果不理想、應注意哪些要點
        更新時間:2024-01-15瀏覽:221次

          ELISA實驗結果不理想、應注意哪些要點


          優化ELISA的重點之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結合抗體所引起的背景信號,從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結合事件被保留,在最后一步產生信號。而不充分的洗滌會導致差異和高背景,從而帶來不理想的結果。

          在做ELISA實驗時,洗板有兩種方法:手工法洗板 和 洗板機洗板。二者沒有本質的差別,只要操作合乎要求,均能得到正確、可靠的結果。

          手工洗板:

          手工洗板人為因素比較大,實驗人員必須經驗豐富,洗滌次數要足夠,沖擊力又不要太大,加入的洗液量以說明書為準,防止孔口內有游離酶未能洗凈,同時防止孔與孔之間液體交叉。洗滌結束后扣干亦非常重要,否則易造成假陽性。每次洗完板后,在吸水紙上輕輕拍干,拍板時要垂直,避免交叉感染。用力不能過猛,防止抗原抗體復合物脫離;吸水紙要一次性使用,應使用不易脫落碎屑的吸水紙為宜。酶結合物不耐干燥,特別在較高的溫度下更易失活,所以拍干的反應板應盡量縮短在空氣中暴露的時間,時間越長,吸光度值越低。

          手工操作有 浸泡式 和 流水沖洗式 兩種方法:

          浸泡式

          1. 吸干或甩干孔內反應液;

          2. 用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后,即甩去);

          3. 浸泡,即將洗滌液注滿板孔,放置1~2分鐘,間歇搖動,浸泡時間不可隨意縮短;

          4. 吸干孔內液體。吸干應,可用水泵或真空泵抽吸,也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干;

          5. 重復操作步驟3和4,洗滌3~4次(或按說明規定)。在間接法中如本底較高,可增加洗滌次數或延長浸泡時間。

          微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的,非離子型洗滌劑既含疏水基團,也含親水基團,其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合,從而削弱蛋白質與固相載體的結合,并借助于親水基團和水分子的結合作用,使蛋白質回復到水溶液狀態,從而脫離固相載體。

          洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,其濃度可在0.05%~0.2%之間,高于0.2%時,可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。


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          流水沖洗式

          流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌,洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置,使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗,持續沖洗2分鐘后,吸干液體,再用蒸餾水浸泡2分鐘,吸干即可。浸泡式猶如盆浴,流水沖洗式則好比淋浴,其洗滌效果更為,且也簡便、快速。

          已有實驗表明,流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓,讓水流沖擊板孔表面,洗滌效果更佳。

          洗板機洗板:

          洗板機洗板人為因素少,速度快,條件恒定,但是使用洗板機洗板時應注意以下三個關鍵點。

          洗滌參數

          主要的參數是洗滌量。自動洗板機會分配洗滌液。如果你之前遭遇過高背景,那么不要猶豫,將洗滌量調為高,最好是比包被體積更高。太少的洗滌液會讓一部分分析表面洗滌不到,從而明顯增加背景。所有反應孔的洗滌量必須相同。

          ELISA試劑盒的使用手冊中有列出洗滌量。我們建議使用350µl洗滌液進行洗滌,以便清潔整個反應孔的壁。一般來說,洗滌量越高,則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。

          洗滌次數

          影響洗滌效果的主要參數是洗滌循環的量。當然,洗滌次數越多,背景越低。然而,太多次的洗滌會降低信號強度,使其難以測定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復洗滌三次。不過,一般而言,包被平板需要的洗滌次數比用戶包被的平板要少。對于用戶包被的ELISA板,必須優化洗滌次數。

          控制洗滌量和洗滌次數的另一種方法是加入過量的洗滌液。一般來說,96孔板的每個孔能容納330至460 µl。不過,有些自動化洗板機可設置程序,分配遠遠超出這個量的洗滌液,比如1 ml。它是如何做到的呢?其實很簡單,就是在分液的同時打開吸液功能。換句話說,隨著分液器分配更多的液體,抽吸器也將液體吸出。這種技術能增加洗滌量,但不會溢出到其他孔中。

          抽 吸

          還有一些參數會影響洗滌步驟的效果。這些參數包括吸液高度和吸入位置,這兩者都能調整,以降低背景(殘留量)和差異。

          殘留液體中包含未結合的抗原或抗體,它們會增加背景信號。殘留量越小,殘留液體越少,轉移到下一步的干擾液體也就越少。

          吸液高度會明顯影響殘留量;如果洗滌吸頭與反應孔底部的距離稍大,那就會讓殘留量急劇增加。反之,如果洗滌吸頭壓著反應孔底部,那么也會使吸液效率降低,殘留量增加。

          目前的洗板機一般使用兩種類型的洗頭:剛性和浮動。浮動洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動,而剛性洗頭則固定在適當的位置。使用剛性洗頭的洗滌操作在優化起來更為復雜,因為你需要非常仔細地調整吸液高度。如果你們實驗室使用幾種不同的板,那可能會很耗時。在使用浮動洗頭時,吸頭會降到反應孔的底部。調整高度就不是很重要,因此洗頭會下降到底部。

          抽吸的位置也對殘留量有著重要影響;如果每個孔只使用一個抽吸點(這很常見,因為更快),那么抽吸的位置需要優化。最佳的位置取決于洗頭的性狀,但它幾乎不在反應孔的中間,即使這是所有洗頭最常見的默認位置。一般來說,最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。

          反應孔的形狀也會影響殘留量。C形底(平底圓角)的微孔板一般會比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。

          洗板時注意事項:

          1. 需每天校正注液量及殘液量,洗滌后殘液量不得大于2 μl。

          2. 及時更換破損吸液針,避免破壞底板包被。

          3. 針對不同廠家酶標板注意調整吸液頭下降高度,避免沖洗針頭卡住酶標板。

          4. 注意調整洗液量,洗液量過多將溢出,過少將達不到洗滌效果。

          5. 關機前使用蒸餾水沖洗管道,避免洗液的結晶物堵塞管道。

          4. 不同種試劑盒的洗液嚴禁混合使用。

          為了洗滌效果較好,實驗室可采用機器與人工洗滌相結合的方法,在機器洗滌后再進行人工洗板1~2次,能達到理想的洗滌效果。ELISA看起來很簡單,但是在實際操作過程中,絕不能掉以輕心,除了嚴謹規范的實驗操作,高品質的試劑盒與專業的技術團隊也是獲得準確結果的保證!

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